Sammelthread Säulenchromatografie

[Joe]

Hey,

ich hab mir -vom Unfälle beim Hobby-Thread inspiriert- gedacht, dass es vllt interessant und informativ sein könnnte, wenn wir mal einen Thread zu SC machen, bei dem einfach jeder seine Erfahrung und Tricks schreibt.

Ich fang einfach mal an:

Zuerst die Methode wie ich sie in der Bachelorarbeit beigebracht bekommen hab:

Ich hab die Säulen immer so gemacht, dass ich das Kießelgel schön in einem Becherglas mit dem Laufmittel angerührt, die Säule ziemlich hoch gefüllt und einen viel zu kleinen Durchmesser genommen hab. Zumindest für meinen jetzigen Geschmack. D.h. ich habe für ca. 3g Substanz eine 3cm-Säule 30cm hoch mit Kieselgel 60 gepackt. Das Laufmittel hab ich in einem 2L-Erlenmeyer gemischt, was deutlich besser geht als mit einem Glasstab im Messzylinder (was ich bei vielen gesehen hab). Zusätzlich hab ich selten mit einem Gradienten gesäult. Damit dann das Reservoir gefüllt und alles schön geklammert. Laufmittel war standardmäßig Cyclohexan/Essigester und zwar so, dass der R_f ca. bei 0.2 lag. Nur wenn der Unterschied der R_f-Werte kleiner als 0.05 war, bin ich mit der Polarität nochmal deutlich runter gegangen oder hab ein anderes Laufmittelgemisch ausprobiert. Mit der Methode hatte ich selten (vllt 1-2x von ca. 50 Säulen) mal das Problem, dass ich ein zweites Mal säulen musste. Der größte Nachteil dabei ist allerdings, dass es ewig braucht und man irre viel LöMi verschwendet.

Und jetzt die Methode die ich mir inzwischen angewohnt habe (beigebracht worden vom besten Assi den ich je hatte  ):

Ich nehm deutlich größere Säulen (für 500 mg 3cm Durchmesser), pack sie aber niedriger. Und zwar packe ich wie folgt: Ich fülle die Säule 12 cm hoch trocken mit Kieselgel und schütte mit "voller Wucht" das Laufmittel in die Säule. Dann natürlich schön durchpumpen, wodurch man eine 1A Säulenoberfläche bekommt.
Wegen des niedrigeren Sdp. nehme ich statt Cyclohexan n-Hexan (allerdings krebserregend). Ich benutzte fast immer Gradienten und fahre die ziemlich steil. Wenn man mit nH:EE 1:0 anfängt (die Säule also mit nH pur packt,) aufpassen, dass man beim Substanz auftragen nicht zu viel DCM nimmt, weil die Säule sonst fast immer reißt. Man sollte aber sowieso aufpassen, dass man nicht mit viel polarem LöMi aufträgt, weil es sonst leicht passiert, dass man eine rießen Mischfraktion im Glas 2 hat.
Wenn ich eine hohe Säule (ca. 40cm hoch) benutze, so dass also viel Platz in der Säule ist, benutze ich oft gar kein Reservoir mehr, sondern fülle die Säule mit dem Laufmittel, pumpe ohne zu klammern (geht schneller und die Gefahr, dass die Säule reißt, wenn der Druck zu schnell reduziert wird, wird verkleinert) und ändere dann den Gradienten wenn die Säule leergelaufen ist. So bekommt man Sachen in 20 Gläsern und mit tüpfeln, packen etc. in 30 min getrennt, wenn man sonst 60-80 Gläser und mind. 1,5h gebraucht hat.
Wie ich finde eine Methode, die es sich lohnt sich anzugewöhnen. Einfach mal ausprobieren.

Ich hab grad leider nicht allzu viel Zeit und Konzentration, deswegen ist es u.U. nicht ganz klar, einfach fragen, falls es Unklarheiten gibt. Bin schon auf eure Erfahrungen, Tipps und Tricks beim Säulen gespannt

VG
Joe

[Phil]

nH:EE 1:0 anfängt (die Säule also mit nH

Gute Idee mit dem Trade.
Was bedeuten diese Abkürzungen oben?
Ich hatte bei einem Öl den Kat heraus geholt in dem ich es über 60 Kieselgel gelassen hatte, am Anfang hatte ich die Säule genau so gemacht wie Du.
Aber es war einfacher das Kieselgel in die Säule zu füllen und dann mit dem Lömi zu füllen, ein wenig Klopfen an den Wänden und etwas Druck dann war die Säule fertig.
Allerdings benötigte man für 1Liter Produkt etwa 100 Liter Lömi.
Eine Pharma Firma in der ich tätig bin hat eine Säule die ist ca. 20m hoch und ca. 1m breit, die reinigen einen Wirkstoff um ca. 6Kg reiner Stoff zu erhalten werden 20m³ Lösemittelabfall produziert.

[Joe]

nH= n-Hexan; CH= Cyclohexan; EE= Essigester.
100 L LöMi?  Hast du da auch wirklich 1 L Produkt rausholen müssen, oder ist das nur das LöMi-Produkt-Verhältnis? Aber des is ja sogar ein relativ gutes Verhältnis, wenn ich mir überleg, dass ich eben für 3g Produkt in der BA teils 60-80* ca. 20mL = 1,2 - 1,4 L gebraucht hab. Was war das für eine Säule und wie lang hast du dafür gebraucht?
So eine Industriesäule würde ich gerne mal live sehen, hab des bisher nur auf Bildern gesehen. Ist bestimmt eindrucksvoll.

[Mephisto]

Ein Sammelthread, finde ich gut! Einige grobe Faustregeln gibt es schon, manches ist aber nur persönlicher Stil. Ich habe während meiner Arbeit an der Uni drei Jahre lang, praktisch jeden zweiten Tag gesäult, daher will ich mich hier beteiligen.

1. Dünnschichtchromatographie
Bevor man mit dem Säulen anfängt, braucht man eine DC, bei der Produkt und Verunreinigungen deutlich unterschiedlich laufen. Dazu wählt man ein Lösungsmittelsystem, bei der es zu einer guten Trennung kommt und das Produkt unterhalb von Rf = 0,5 kommt. Diese Ergebnisse kann man auf die Säule übertragen (auf gleiche Porengröße achten, meist 60 Å), wobei man eine Säule in der Regel etwas unpolarer laufen lässt als die DC. Das meistverwendetste Lösungsmittelsystem ist Hexan/Etylacetet.

2. Säulengröße
Die Menge an eingesetztem Kieselgel hängt von der Menge zu trennender Mischung und der Schwere der Trennung ab. Bei einem ΔRf = 0,1 oder kleiner handelt es sich um eine schwere Trennung und man verwendet eine Verhältnis von Probe zu Silica von 1:100. Allgemein gilt diese Faustregel:
Silica_Verhaeltnis_Probe.png (4.72 KB . 314x482 - angeschaut 1770 Mal) Die Form der Glassäule hat wenig Einfluss auf die Trennleistung, da das Volumen an Kieselgel gleich bleibt. Die Fritte ist eines Blickes würdig: P1 lässt Kieselgel durch (huch so viel Ausbeute ) und bedarf Watte und/oder Sand, frittenlose Säulen bekommen eine kleine Kugel aus Watte in die Verjüngung. P3 ist Standard, aber die Fritten setzen sich irgendwann mit Schwerlöslichem zu und müssen mit Königswasser gereinigt werden.

3. Packen der Säule
Man kann die Säule verschieden packen, z.B.:
Durch Aufschlämmen des Kieselgels im Eluenten in einem Becherglas, Eingießen in die Glassäule und Verdichten mittels Klopfens und Druckluft (einfach, aber viel Abwasch)
Durch Schütteln des Kieselgel in der Säule mit dem Eluenten und anschließendem Verdichten.
Wie von Joe beschrieben, durch Durchpressen von Eluenten in das trockene Kieselgel in der Säule. Eine Variation davon ist, Vakuum am unteren Säulenende anzulegen.
Egal welche Art man bevorzugt, ist das Ziel, Luftblasen im Kieselgel zu vermeiden. Diese führen zum Reißen der Säule, sobald die Säule unter Druck stand und der Druck wieder aufgehoben wird, da die Luft dann expandiert. Unebene Säulenoberflächen lassen sich hingegen durch Aufschlämmen mit dem Spatel wieder beheben.

4. Auftragen der Probe
Entweder man trägt die Probe gelöst auf oder aufgezogen auf Kieselgel auf die Säule auf. Anders als bei der HPLC kann man zum Lösen durchaus polarere Lösungsmittel als den Eluenten verwenden. Je größer das Volumen der Probe im Lösungsmittel desto schlechter die Trennwirkung. Also möglichst konzentriert auftragen und effizient nachspülen. Pipetten verwenden und diese nicht abbrechen.
Mein Favorit ist das Aufziehen auf Kieselgel, da man ein sehr kleines Probenvolumen hat. Dazu wiegt man zur Probe die doppelte Menge an Kieselgel ein und löst alles in DCM und fügt bei Bedarf etwas Methanol bei Löslichkeitsproblemen zu. Anschließend zieht man die homogene Suspension langsam am Roti vollständig trocken.

fc-dry-load.jpg (104.13 KB . 750x628 - angeschaut 1640 Mal) Idealerweise hat man dabei anstatt eines Tropfenfängers ein NS-Übergangsstück samt Fritte am Kolben, da die Kieselgel-Aufschlämmung zu starken Siedeverzügen neigt. Nach dem Trockenziehen kann sollte die Probe auf dem Kieselgel leicht rieselfähig sein (wenn nicht, nicht trocken genug, bzw. mehr Kieselgel verwenden). Mit einem Pulvertrichter kann die Probe anschließend auf die Säule geschüttet werden, über der nur einige mm Eluent steht. Klopfen mit einem Korkring erspart hier ein Nachspülen.
Ob und wo man Sand verwendet ist Geschmackssache, über der Probe schützt sie die Säule vor Aufschlämmung bei Nachfüllen des Eluenten.

5. Druck
Entweder man pumpt selber etwas Druck auf die Säule oder verwendet Druckluft aus der Leitung. Bei letzterem ist ein Druckminderer mit Manometer notwendig. Man kann mit Drücken unter 1 bar arbeiten, das halten alle Säule aus. Über einem bar besteht die große Gefahr, dass die Säule oder das Reservoir platzen können. Zwischen Säule und Reservoir verwendet man am besten eine Schliffklemme mit Feststellschraube, aber zwischen Reservoir und Druckluftadapter eine Metallklemme ohne Feststellschraube.

[Heuteufel]

Mal einfach ein paar Anmerkungen wie ich es so kenne (nicht als Korrektur aufzufassen  ):

Das meistverwendetste Lösungsmittelsystem ist Hexan/Etylacetet.

Ich säule häufig mit Petrolether/Ethylacetat - ist billiger. Übrigens: Wenn es ums Sparen geht: Das durch Abrotieren zurückgewonnene Lösungsmittel ist in vielen Fällen perfekt rein (ich hab mal über 20 Mal getüpfelt und unter UV war absolut nichts zu erkennen). Kann man eigentlich nach einer kurzen Prüfung problemlos nochmal für den gleichen Zweck verwenden.

Die Form der Glassäule hat wenig Einfluss auf die Trennleistung, da das Volumen an Kieselgel gleich bleibt.

Ich will das an sich gar nicht abstreiten - praktisch läuft es aber darauf hinaus, dass ich wie Joe dazu tendiere breite Säulen zu bevorzugen. Wenn man mit einer zu engen Säule arbeitet (resp. zu wenig Kieselgel hat, weil die Säule ja noch in den Abzug passen muss) verlaufen die Fraktionen häufig und man erhält viele Mischfraktionen. Je breiter die Säule ist, desto enger und besser getrennt sind die Fraktionen (kann aber auch letzendlich an der Menge von Kieselgel liegen).

3. Packen der Säule
Man kann die Säule verschieden packen, z.B.:
Durch Aufschlämmen des Kieselgels im Eluenten in einem Becherglas, Eingießen in die Glassäule und Verdichten mittels Klopfens und Druckluft (einfach, aber viel Abwasch)

Mach ich immer so. Ein Becherglas ist doch nicht viel Abwasch!  Am liebsten bereite ich die Säulen für den nächsten Tag schon immer am vorherigen Tag vor (natürlich ohne Substanz drauf); das Kieselgel verdichtet sich beim Stehen über Nacht merklich!

Mein Favorit ist das Aufziehen auf Kieselgel, da man ein sehr kleines Probenvolumen hat. Dazu wiegt man zur Probe die doppelte Menge an Kieselgel ein und löst alles in DCM und fügt bei Bedarf etwas Methanol bei Löslichkeitsproblemen zu. Anschließend zieht man die homogene Suspension langsam am Roti vollständig trocken.

Das mache ich einfach immer so. Nur mit Celite und nicht mit Kieselgel. Celite adsorbiert die Substanz nicht und deshalb wird die Substanz augenblicklich freigesetzt. Kieselgel setzt die Substanz langsamer frei, was zumindest in der Theorie dazu führen kann, dass die Banden breiter und die Trennung schlechter wird. Oder gibt es gute Argumente für Kieselgel?

Ansonsten:

Bei Aminen, etc. gebe ich immer 1Vol% Triethylamin zum Lösungsmittelgemisch und bei Polyolen, etc. 1Vol% Eisessig. Dann schmieren die Substanzen nicht so die Säule runter.

Das Tüpfeln bei den DC´s der Produktfraktionen mache ich übrigens immer mit einer Pasteurpipette, deren Spitze ich mit dem Feuerzeug zur Kapillare ausziehe. So hat man ein handliches Tüpfelwerkzeug. Nach jedem Tüpfeln kurz in DCM tunken und dann an Papier abtupfen, damit man keine Substanz verschleppt.

Oft ist es ein fataler Fehler sich an der Farbigkeit der Banden zu orientieren: Die durch Nebenreaktionen gebildete Farbstoffe färben die Säule schon in Konzentrationen, wo man sie auf dem DC nicht mal detektieren kann, und laufen nicht selten unabhängig von den eigentlichen Komponenten des Gemischs. Beispiel, das ich mal kürzlich hatte: Eine gelbliche, eine orange, eine bränliche und eine farblose Bande. Die gelbliche enthielt nichts außer ganz wenig Farbstoff, die orange bis zur Mitte eine Verunreinigung. Die bräunliche noch bis zur Mitte Verunreinigung, dann Produkt. Die farblose ebenfalls Produkt. Der bräunliche Farbstoff ließ sich leicht durch Waschen mit ein wenig Petrolether entfernen...

So und jetzt noch Fragen:

Wann verwendet ihr Aluminiumoxid?

Was sind eure Erfahrungen mit abgewandelten Methoden. Siehe z.B. hier: http://forum.lambdasyn.org/index.php/topic,1344.0.html
Ich zitiere mal den interessanten Teil von Kanonenfutter:

Die Trockensäule, zumindest so wie ich sie kenne, läuft so ab: Es wird eine Glassäule mit Schliff und Schlaucholive wie üblich mit Säulenmaterial z.B. Kieselgel gepackt (Quellen lassen etc...). Die zu trennende Probe wird auf der 3-5 fachen Menge Säulenmaterial aufgezogen und auf die gepackte Säule gegeben. Nun gibt man den Eluenten portionsweise z.B. 150 ml (je nach Säulengröße, es muss ja schon etwas herauseluiert werden) auf die Säule und zieht langsam unterdruck bis das Säulenmaterial trocken gelaufen ist. So wird die erste Fraktion in Kolben1 aufgefangen. Jenachdem welche polaritäten man vorher durch DC-Versuche bestimmt hat wird nun die nächste Portion Eluent auf die Säule gegeben und wirder Unterdruck angelegt und im nächsten Kolben aufgefangen. Es wird so lange die Polarität erhöht bis alle Fraktionen aufgefangen sind.
Jenachdem wie das Trennproblem ist, hat man nun einzelne Kolben mit Stoffgemischen weiter aufgetrent oder gleich schon relativ reine Substanzen pro Kolben.

Nach meine Erfahrung eignet sich diese Art von Säulenchromatographie nur in einigen speziellen Fällen. Diese muss man aber durch mühseliges Ausprobieren finden. Ich würde daher immer die normale (Flash)-Säulenchromatorgaphie bevorzugen.

Hat schon mal jemand eine luft/feuchtigkeitsempfindliche Substanz unter Inertgas-Bedingungen gesäult?

[Mephisto]

Ich säule häufig mit Petrolether/Ethylacetat - ist billiger. Übrigens: Wenn es ums Sparen geht: Das durch Abrotieren zurückgewonnene Lösungsmittel ist in vielen Fällen perfekt rein (ich hab mal über 20 Mal getüpfelt und unter UV war absolut nichts zu erkennen). Kann man eigentlich nach einer kurzen Prüfung problemlos nochmal für den gleichen Zweck verwenden.

Das was die Unis als Hexan zum Säulen bestellen, ist übrigens oft weder n- noch cyclo-Hexan, sondern ein technisches Hexan Isomerengemisch, da dies günstiger ist. Also auch ein Mischmasch wie Petrolether. Wenn man isokratisch säult kann natürlich ständig im Kreislauf Abrotieren und spart viel Lösungsmittel. Das habe ich auch so gemacht. Aber wieso hast Du destilliertes LöMi getüpfelt?

Ich will das an sich gar nicht abstreiten - praktisch läuft es aber darauf hinaus, dass ich wie Joe dazu tendiere breite Säulen zu bevorzugen. Wenn man mit einer zu engen Säule arbeitet (resp. zu wenig Kieselgel hat, weil die Säule ja noch in den Abzug passen muss) verlaufen die Fraktionen häufig und man erhält viele Mischfraktionen. Je breiter die Säule ist, desto enger und besser getrennt sind die Fraktionen (kann aber auch letzendlich an der Menge von Kieselgel liegen).

Das hängt wirklich sehr vom Verhältnis Probe zu Kieselgel ab. Bei den 1:100 (Probe:Silica) Säulen hatte ich bei langen, schmalen Säulen immer eine bessere Trennleistung als bei kurzen, breiten Säulen. Die Bodenzahl einer Säule erhöht man am einfachsten durch eine größere Länge der Säule.

Was sind eure Erfahrungen mit abgewandelten Methoden.

Ich hatte gute Erfahrungen mit automatischen Flash-Systemen. Da kann man einen Kaffee trinken und ein Paper lesen, während die Maschine die Säule nach dem programmierten Gradienten macht. Gerade bei sich wiederholenden Routinesäulen eine große Hilfe. Über einen normalen Fraktionssammler war ich schon froh als ich ein paar Mal Sephadex-Größenausschlusschromatographie machen musste. Da lief die Säule 24 h. Desweiterem ist C18 eine feine Sache und nicht nur der HPLC vorbehalten.

[Heuteufel]

Aber wieso hast Du destilliertes LöMi getüpfelt? Smiley

Aus Paranoia: ich war von dem Gedanken besessen, es könnte bei der Destillation eine leichtflüchtige Verunreinigung mit übergegangen sein und musste dies unbedingt ausschließen.  Nein aber jetzt mal im ernst: Das ist alles eine Folge der Gedankenmanipulation durch Sigma-Aldrich. Da steht in sehr kleinen Schrift auf jedem Gebinde "Du darft nur Lösungsmittel aus frisch geöffneten Gebinden von Sigma-Aldrich verwenden!" Das prägt sich unbemerkt ins Unterbewusstsein ein... 

Das hängt wirklich sehr vom Verhältnis Probe zu Kieselgel ab. Bei den 1:100 (Probe:Silica) Säulen hatte ich bei langen, schmalen Säulen immer eine bessere Trennleistung als bei kurzen, breiten Säulen. Die Bodenzahl einer Säule erhöht man am einfachsten durch eine größere Länge der Säule.

Glaube ich dir gerne. Gut zu wissen!

Ich hatte gute Erfahrungen mit automatischen Flash-Systemen. Da kann man einen Kaffee trinken Grin

Es gibt auch Leute, die das bei normalen Säulen tun  ("Ups, da ist die Säule wohl trockengelaufen - wie konnte das denn passieren?!  ").

[Mephisto]

Das mache ich einfach immer so. Nur mit Celite und nicht mit Kieselgel. Celite adsorbiert die Substanz nicht und deshalb wird die Substanz augenblicklich freigesetzt. Kieselgel setzt die Substanz langsamer frei, was zumindest in der Theorie dazu führen kann, dass die Banden breiter und die Trennung schlechter wird. Oder gibt es gute Argumente für Kieselgel?

Bei letzten Posting hab ich es ganz vergessen: Die Idee mit dem Aufziehen auf Celite gefällt mir gut. Wenn ich es mir überlege, könnte Celite besser sein als Silica. Mit der Silica-Methode war ich zwar zufrieden, aber der Vergleich zum Celite fehlte mir. Weniger Runterschmieren wäre aber manchmal wünschenswert. Danke für den Tipp.

[Phil]

Hier wurde auch gesäult http://forum.lambdasyn.org/index.php/topic,754.msg3867.html#msg3867
Tips und Tricks über Alox http://forum.lambdasyn.org/index.php/topic,629.0.html und http://userpage.chemie.fu-berlin.de/~tlehmann/gp/laborpraxis/trocknen-alox.html
Wie füllen was beachten. saeule.pdf (103.5 KB - runtergeladen 1645 Mal)

[Heuteufel]

Danke Phil, besonders der Thread im Forum zu Alox ist sehr informativ! 

[facer]

Woher bezieht ihr alle euer Kieselgel ? Bin gerade mal wieder auf der Suche danach.
Vielleicht gibt es eine günstig und einfache Quelle.

[Phil]

Sigma VWR ACROS

[facer]

Dachte eher an was wo auch Privatperson bestellen können ^^

[Phil]

Versuche mal bei einem Hersteller zu bestellen oder in einer Apotheke oder Drogerie.

Film zum Thema mit Molekularsieben

[Phil]

Ich habe gute Links über DC gefunden Link über DC gefunden   oder hier oder hersteller