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  • 16. Februar 2025, 01:05:01

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Autor Thema: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin  (Gelesen 7453 mal)

Hyperion76

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Hallo,

ich möchte hier einfach mal kurz meine Ergebnisse eines - in meinen Augen sehr schönen Versuches zur Diskussion stellen.

Der Versuch lässt sich leicht in wenigen Tagen durchführen lässt. Alle Aufnahmen entstanden daheim, also nichts was man nur an einer Uni o. Ä. machen kann. (Ich erhebe nicht den Anspruch das der Versuch in die Sammlung wander, nur nebenbei)

In dem Versuch wird Prodigiosin aus dem Mikroorganismus Serratia marcescens isoliert. Prodigiosin ist blutrot im sauren (wenn es konzentriert ist, dazu reicht schon Kohlensäure oder schwache Fettsäuren) und gelb im alkalischen. Der Keim wächst auch auf Brot und wird so für das ein oder andere Blutwunder in der kirchlichen Geschichte verantwortlich gemacht.

Da ich sehr wenig Zeit habe Zeit (60 h / Woche Fulltimejob) gibt es hier einfach mal unkommentiert eine Darstellung mit Bildern. Die Sachen sind eigentlich fast selbsterklärend, ansonsten stehe ich für Fragen aber gerne zur Verfügung!

Nach etwa 48 h Kultur in LB Medium wurden Zellen und Überstand durch Zentrifugation getrennt. Der Überstand wurde einmal im Verhältnis 1:1 kalt extrahiert, die das Bakterienpellet unter gelegentlichem vortexen im 60 °C Wasserbad.

Die vereinigten Extrakte wurden im WB unter Zuführung eines leichten Luftstromes auf > 2ml eingetrocknet (siehe Bild) und nochmal zentrifugiert.

Extrahiert wurde mit einer 1:1 Mischung aus Ethylacetat und Aceton, die Spektren wurden aber in saurem / basischem Ethanol aufgenommen (100 µl des Rohextrakts durch einen Luftzug trocknen lassen und in 1 ml EtOH + 1 ml wässrige 3 % HCL bzw. 5 % NaOH aufnehmen).

Die Absorptionsmaxima stimmen mit denen aus der Literatur fast überein (je nach Quelle, 535 und 470 laut unterer).

Da der Rohextrakt natürlich noch andere lipophile Substanzen enthält (Steroide, Membranbestandteile, lipophile Aminosäure usw.) ist das Spektrum natürlich nicht das des Reinstoffes. Protokolle für aufwändigere Reinigungen (Säulenchromatographie usw.) finden sich aber im Internet in diversen Papern.

Zitat
"Cloning and Expression in Escherichia coli of Serratia marcescens Genes Encoding Prodigiosin Biosynthesis"
STEVEN A. DAUENHAUER,t RICHARD A. HULL, AND ROBERT P. WILLIAMS*
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 1984, p. 1128-1132 Vol. 158, No. 3
doi 0021-9193/84/061128-05$02.00/0
1984, American Society for Microbiology


* Prodigiosin.jpg (185.46 KB . 991x759 - angeschaut 562 Mal)
EDIT. Warum kann man hier keine Bilder direkt einbinden?

Grüße Hyperion

Edit by Mephisto: Bild hochgeladen (Tipp: PNG = Vektorgrafiken, JPG = Fotos).
« Letzte Änderung: 20. Januar 2012, 22:24:05 von Mephisto »

PlanetScience

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #1 am: 19. Januar 2012, 13:13:17 »
Hallo Hyperion76, willkommen im Forum. Auf deine Frage, warum man keine Bilder einbinden kann: Das geht, beim Erstellen eines Beitrags kannst du unter Erweiterte Optionen... Dateien hochladen und dann im Beitrag einfügen. Externe Bilder können nicht direkt verlinkt werden, weil dann der Besitzer der verlinkten Bilder evtl. persönliche Informationen zu allen Personen erhält, die dieses Thema betrachten.
« Letzte Änderung: 20. Januar 2012, 10:59:03 von PlanetScience »
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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #2 am: 19. Januar 2012, 16:59:49 »
Schön!

Gibt es eine ungefähre Angabe, wie viel Prodigiosin pro 1000g Zellkultur ca. extrahierbar ist?

Hyperion76

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #3 am: 19. Januar 2012, 17:15:58 »
Zitat
Gibt es eine ungefähre Angabe, wie viel Prodigiosin pro 1000g Zellkultur ca. extrahierbar ist?

Das hängt sowohl von dem verwendeten Stamm ab, als auch von den Kulturbedingungen (Temperatur, pH, Belüftung) und dem Medium.

Hochleistungsstämme schaffen in entsprechenden Medien auch mal 20-50 mg/ml.

Normele Stämme in Standardnährmedien bei 30°C nach 2-3 Tagen eher so um die <=1-2 mg/ml.

Ich habe hier für einen ersten Test normales LB genommen, werde demnächst mal Nutrient Broth (Difco) + 2 % Maltose probieren.

Die Industrie nimmt oft irgendwelche Ölextrakte wie Peanut Seed Broth oder Sesam Seed Broth oder setzt irgendwelche Öle hinzu, damit soll sich die Ausbeute um mehrere 100% steigern lassen. Warscheinlich weil die Öle irgendeine bestimmte Fettsäure enthalten, die im Syntheseweg (der noch nicht komplett aufgeklärt ist) eine Rolle spielt.

Ethylacetat und Aceton bilden mit dem Medium übrigens eine schwer trennbare Emulsion (Kühlschrnak über Nacht bewirkt kaum Trennung). Ich habe meine Zentrifuge zur Trennung benutzt (bei 17.000 g ne Sache von Sekunden), wollte man das im großen Maßstab machen, müsste man sich was überlegen, nicht nur zur Rückgewinnung des Lömis.
Das meiste des Farbstoffes ist eh im Pellet, evtl kann man auch auf den Kulturüberstand verzichten.


« Letzte Änderung: 19. Januar 2012, 17:19:30 von Hyperion76 »

Heuteufel

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #4 am: 19. Januar 2012, 22:51:07 »
Schön, bin schon gespannt auf die Fotos! [daumenhoch]

Das isolierte Produkt scheint ja wirklich recht interessante Eigenschaften zu haben...
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Hyperion76

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #5 am: 20. Januar 2012, 10:23:41 »
Zitat
Schön, bin schon gespannt auf die Fotos!

Die Fotos in dem Link hast du gesehen?


Zitat
Das isolierte Produkt scheint ja wirklich recht interessante Eigenschaften zu haben...

Ja, vorallem lustig wie das bei den Papern ist. Die ganzen chemischen Sachen wie eine Titrationskurve oder Spektren wurden meist schon in den 60 +- 10 Jahre veröffentlich. Dann war Ewigkeiten Ruhe und kaum deklariert jemand das Zeug als potentiellen Anti Tumor Wirkstoff stürzen sich wieder alle darauf.

Ach wäre das schön wenn Wissenschaft nicht die Hure der Wirtschaft und Politik wäre...

Mephisto

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #6 am: 20. Januar 2012, 22:01:32 »
Endlich mal etwas Biochemie. Karma +1.

Der Versuch lässt sich leicht in wenigen Tagen durchführen lässt. Alle Aufnahmen entstanden daheim, also nichts was man nur an einer Uni o. Ä. machen kann.

Das ist natürlich ein guter Ansatz, wobei für mich der Knackpunkt ist, woher man Serratia marcescens bekommen kann. Kennst Du eine Bezugsquelle oder meinst Du, man kann das Bakterium in der Umwelt finden und dann die Kolonie z.B. anhand der Färbung auf einer Agarplatte identifizieren? Nähere Informationen und Tipps würden mich sehr interessieren.
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Heuteufel

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #7 am: 20. Januar 2012, 23:35:29 »
Zitat
Die Fotos in dem Link hast du gesehen?
Ups, nein, war wohl schon etwas zu spät in der Nacht, als ich den Post gelesen habe.
Jetzt habe ich sie aber gesehen-hast ja eine ganz solide Ausstattung daheim! Umso besser. [dance]
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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #8 am: 21. Januar 2012, 12:15:28 »
Zitat
Ups, nein, war wohl schon etwas zu spät in der Nacht, als ich den Post gelesen habe.
Jetzt habe ich sie aber gesehen-hast ja eine ganz solide Ausstattung daheim! Umso besser.

Danke! Wobei man natürlich jetzt nicht so komfort Geräte mit Probenwechsler usw. braucht. Ein altes Spektrometer von Ebay und eine analoge Zentrigue aus dem Medizinbereich tuts auch, notfalls muss man eben länger zentrifugieren, gibt ne schöne Formel dazu mit deren Hilfe man die Zeit und g umrechnen kann!

Zitat
Das ist natürlich ein guter Ansatz, wobei für mich der Knackpunkt ist, woher man Serratia marcescens bekommen kann. Kennst Du eine Bezugsquelle oder meinst Du, man kann das Bakterium in der Umwelt finden und dann die Kolonie z.B. anhand der Färbung auf einer Agarplatte identifizieren? Nähere Informationen und Tipps würden mich sehr interessieren.

Also der Keim kommt ubiquitär vor. Wenn du z. B. in einer nicht oft geputzten Dusche einen rosa Schmier irgendwo an den Fugen hast, das ist meistens S. marcescens. Ich habe es shconmal probiert den dort zu isolieren, jedoch werden die Abstriche immer von Hefen und anderem Zeug überwuchert, da muss ich nochmal was ausprobieren.

Wenn du magst kann ich dir bei Interesse auch ein 2 ml Schraubröhrchen mit einer Agarstechkultur schicken (for free) , mein Stamm ist ein Typstamm von der DSMZ.

Mephisto

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Re: Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Prodigiosin
« Antwort #9 am: 22. Januar 2012, 21:30:23 »
Wenn du magst kann ich dir bei Interesse auch ein 2 ml Schraubröhrchen mit einer Agarstechkultur schicken (for free) , mein Stamm ist ein Typstamm von der DSMZ.

Danke für das liebe Angebot! Ich fragte aus generellen Interesse und weil es sicher auch alle interessiert, die die Anleitung durchführen wollen. Mir selbst fehlt leider die Zeit für Heimexperimente.
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