Phasin-Extraktion aus roten Nierenbohnen

[Joe]

Ahoj,

ich denke gerade über einen kleinen Extraktionsversuch nach, habe aber mit der Isolierung von Proteinen bis jetzt keinerlei Erfahrung.
Mein Vorgehen wäre folgendes:

- Die wahnsinns harten Bohnen auf mühsame Weise zerkleinern bis möglichst ein Mehl vorhanden ist

- Bohnen evtl. zuerst mit Aceton entfetten (denaturiert dabei das Protein?)

- In der Kälte (Kühlschrank; sonst könnten in der Bohne [auch wenn geschreddert] die Keimprozesse aktiv werden, welche beim Phasin abbauen) in Wasser über Nacht stehen lassen (habe auch in der Beschreibung eines Papers [an welches ich leider nicht herankomme] etwas über Lektinextraktion mittels wässriger AcOH gelesen, weiß da wer was dazu?)

- Abfiltrieren, anschließend nochmal extrahieren

- mit Ammoniumsulfat aussalzen -> Rohphasin (damit coolen "Test" mit Blut machen, wenns geklappt hat - dafür reichts auf jeden Fall - klumpt das Blut zusammen  )

- ??? Reinigen ohne Chromatographie, Ultrazentrifugation.. irgendeinen aufwendigen Aufbau ???

Man wird dabei aber vermutlich ein sehr wildes Proteingemisch aus den (sehr eiweißreichen) Bohnen erhalten. Kann mir da vielleicht jemand weiterhelfen? Der experimentelle Aufbau muss mangels Gerätschaften sehr gering bleiben.

VG

Joe

[Phil]

Die Bohnen würde ich mit einem Pyrierstab zerkleinern oder mit einer Kaffeemühle das geht sehr gut.

[Joe]

Pürierstab geht leider nicht so gut, hab ich gestern schon ausprobiert, Kaffeemühle hab ich keine.

Habe im übrigen gestern ein paar Bohnen (~25) schon so gut als möglich zerkleinert und über Nacht in ca. 20 mL Wasser. Von dem "Extrakt" hab ich 1 mL genommen und in wässriges Blut, leider ist gar nichts mit dem Blut passiert -> anscheinend ist nichts großartig übergegangen, sonst wäre das Blut auf jeden Fall agglomeriert. Ich probiers vielleicht wirklich mal mit wässriger AcOH. Habe aber leider auch in der Apo heute kein Ammoniumsulfat bekommen, so dass ich das Experiment sowieso ein wenig verschieben muss.

[Heuteufel]

Hast du Folgendes http://jpkc.hnadl.cn/download/20100322215328_462086206234.pdf schon gelesen? Seite 7 - 8 wirds interessant. Das zusammen mit den angegebenen Referenzen sollte eigentlich für ne Extraktions und Aufreinigungsstrategie reichen.

Was das Zerkleinern angeht: "Will it blend?" 
Ansonsten: In Alufolie und Frischhaltefolie einwickeln und mit dem Hammer draufkloppen hat mir zB. bei den Goldregensamen (http://www.lambdasyn.org/synfiles/cytisin.html) den gewünschten Erfolg gebracht.

[Joe]

Dankschön Heuteufel. Des is ja ziemlich des Vorgehen des ich auch angedacht hatte. Die Affinitätschromatografie werd ich aber wohl leider nich durchführen können.
Darauf beruht im Übrigen -zumindest zum Teil- die Giftigkeit von Phasin (ein Phytohämagglutinin). Durch hohe Affinität zu Zuckern kommts zur Agglutination von Blutkörpern etc.. (siehe Bild, inzwischen gings mit dem Blut)

Jetzt mach ich mich dann nächste Woche wenn ich endlich ein bisschen Ammoniumsulfat bekomme (hoffentlich) erst mal ans Rohextrakt. Wird nur ohne Zentrifuge eh eine langwierige und vermutlich nervtötente Angelegenheit werden. Zum Glück hab ich inzwischen ne Vorrichtung zum Absaugen mit Vakuum.
Geht statt Ammoniumsulfat eigentlich auch Ammoniumacetat? Lt. Hofmeister-Reihe ist des ja nach dem Sulfat und dem Phosphat die dritte Wahl. Oder denaturiert dadurch das Protein bereits?

Jo, hab die paar gestern auch in ne dicke Plastiktüte und dann mit dem Hammer drauf, nachdem der Pürierstab nur mäßigen Erfolg gebracht hat, und dabei im schlimmsten Fall kaputt gegangen wär [womit hätt ich dann Kürbissuppe machen sollen ???    ].